细胞冻存程序降温时间（细胞冻存降温梯度）
2024-07-06本文目录一览：
1、程序性冻存盒多久能到-80
2、如何冻存细胞
3、细胞冻存的操作步骤是什么？
4、梯度降温4度放多久
5、细胞梯度冻存,指的是哪四种温度环境下
程序性冻存盒多久能到-80
程序性冻存盒多久能到-80，程序性冻存盒4个小时能到-80，走程序降温盒过程,在—80度存放4个小时就可入液氮(程序降温盒在一个半小时即可从室温降至—80度)。另有书中提到走泡沫盒子的程序,细胞置于—80度冰箱可最长达一周时间。
如何冻存细胞
一、材料
（一）仪器
1.
净化工作台
2.
离心机
3.
恒温水浴箱
4.
冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5.
倒置相差显微镜
6.
培养箱
7.
液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1.
吸管（弯头、直头）
2.
培养瓶
3.
玻璃瓶（250ml、100ml）
4.
废液缸
（三）塑料器皿
1.
吸头
2.
枪头
3.
胶塞
4.
移液管（10ml）
5.
15ml离心管
6.
冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1.
微量加样枪
2.
红血球计数板
3.
记号笔
4.
医用橡皮膏
5.
移液枪
（五）试剂
1.
D-Hanks液
2.
小牛血清
3.
培养液
4.
双抗（青霉素、链霉素）
5.
胰蛋白酶（0.08%）
6.
1NHCl
7.
7.4%NaHCO3
8.
DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
二、操作步骤
（一）细胞冻存
1.
配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2.
取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3.
离心1000rpm，5min；
4.
去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5.
将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5
ml；
6.
在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7.
冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/
min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h
，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二）
细胞复苏
1.
从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.
从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.
离心，
1000rpm，5min；
4.
弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.
次日更换一次培养液，继续培养。
三、注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞冻存的操作步骤是什么？
1.
配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2.
取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3.
去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
4.
离心1000rpm，5min；
5.
去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.
将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5
ml；
7.
在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.
冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/
min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h
，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞冻存管融化
1.将细胞冻存管取出，浸入37℃水浴锅内，轻轻晃动，注意融化，当融得只剩一个小冰块时，将细胞插入冰中。
2.加入4℃预冷的培养基，用手指轻弹悬浮细胞团。
3.250g离心10min，去除上清液，再加入培养基，轻轻悬浮。
4.尽量将细胞中的DMSO洗去，计数。
在细胞冻存过程中，所结的冰晶对细胞伤害较大，所以过程一定要慢，DMSO能减少冰晶伤害。在细胞复苏过程中，要快，以减少融化对细胞的伤害，其实还是冰晶的问题。DMSO浸润的细胞非常脆弱，所以可要尽快将DMSO去除，一定要轻。
梯度降温4度放多久
梯度降温是目前大多数实验室常用的细胞冻存方法，其中在4℃的放置时间为30分钟。
细胞梯度冻存,指的是哪四种温度环境下
4度，－20度，－80度，–196℃。
细胞冻存一般逐级降低温度，4度30min-1h，不要超过一个小时。－20度30min，不要超过30min，或者可以不需要，直接放到－70到－80度的冰箱，过夜，这一步是必须的，不过还要看细胞类型，癌细胞应该还好一些，人表皮角质化细胞在－20度放了超过一个小时，拿出来检测，细胞有一半多已经失去活力了。
细胞冻存应逐级梯度降温是为了使细胞内的水分缓慢渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。细胞冻存是常用的实验手段，但不同的细胞冻存方法可有差异，应按细胞说明使用或者实验摸索，更多医学知识应咨询专业人员。